摘要 本文采用毛細(xì)管對流 PCR 平臺將毛細(xì)管安裝在溫度為 95°C 的加熱器上，通過自然對流實現(xiàn) PCR 循環(huán)。

毛細(xì)管底部(高溫區(qū)域) 樣品通過浮力驅(qū)動上升，同時使模板變性。樣品上升過程中，因周圍空氣的冷卻使其溫度下降。

當(dāng)樣品到達(dá)毛細(xì)管頂部(低溫區(qū)域)時，開始進行退火和延伸，隨后 DNA 模板下沉并再次加熱。

引物和擴增子設(shè)計對 DNA 擴增成功與否至關(guān)重要。

術(shù)語 CCPCR :Capillary Convective PCR

簡介

由溫度梯度內(nèi)的流體密度變化引起的自然對流可用于 DNA 擴增。當(dāng)樣品在自然對流作用下在不同溫度區(qū)域重復(fù)循環(huán)時，樣品可能會在一次循環(huán)中經(jīng)歷 PCR 擴增的三個步驟----核酸變性，退火和延伸。

對流 PCR 可以將擴增時間從數(shù)小時縮短至 30-40 分鐘。但是，當(dāng)前的對流 PCR 系統(tǒng)使用兩個或多個獨立的溫度控制器和復(fù)雜的系統(tǒng)設(shè)計，需要特定形狀的管道或額外的腔室才能使流體完全循環(huán)。

此外，某些操作需要特定的技巧，如從細(xì)管中裝載和卸載試劑以及密封管的兩端而不將氣泡困在里面。每一步操作對成功擴增都至關(guān)重要。

此外，因沒有研究對比傳統(tǒng) PCR 和對流 PCR 在引物和擴增子設(shè)計上的差異，從而限制了對流 PCR 的廣泛應(yīng)用。

毛細(xì)管對流 PCR 平臺

如圖 1 所示，毛細(xì)管對流 PCR 采用帶有溫度反饋控制功能的熱浴鍋作為熱源。樣品容器為一種具有封閉式底部的商業(yè)玻璃毛細(xì)管 (100 ul)，長 51 mm，其內(nèi)徑和外徑分別為 2.3 mm 和 3.2 mm。

將兩個具有不同鉆孔深度（4 mm 和 30 mm）的加熱塊放入溫度維持于 95°C 的熱浴鍋中。(有意思，也就是它的熱源是 水 唄)

首先將裝有樣品的玻璃毛細(xì)管放入 30 mm 深的加熱塊上。在 10 min 內(nèi)通過熱傳導(dǎo)將整個試管完全加熱以激活 Taq DNA 聚合酶。

之后，將管子轉(zhuǎn)移到 4 mm 深的加熱塊上，并采用塑料毛細(xì)管支架支撐。僅在底部加熱試管 30 min，便可進行 DNA 擴增。

圖 1 兩個加熱塊放置在 95° 的熱浴鍋中

樣品上部覆有10μL 礦物油。2ul 的 CPCR 產(chǎn)物采用 瓊脂糖凝膠電泳分析。

粒子圖像測速和溫度測量

通過粒子圖像測速技術(shù)(PIV) 對毛細(xì)管 (75ul) 中流體的流動進行了觀察。其中，h / d = 7.7 ( h / d 表示毛細(xì)管中樣品的高度與毛細(xì)管內(nèi)徑之比)。

試劑采用去離子水，直徑 50μm 的polystyrene polyamide particles 作為 trace particle (:1005 )。

預(yù)熱 10 min 后，采用 Nd：Yag 激光 ( λ= 532 nm ) 作為激發(fā)光，示蹤顆粒在 ?585 nm 處發(fā)熒光。圖像以每秒 15 幀的速率在 CCD 相機上被捕獲。

試劑和油之間的溫度（）采用溫度記錄儀測量。

結(jié)果與討論

如圖 2A 所示，在此平臺中，當(dāng)毛細(xì)管從下端加熱，上端被周圍的空氣冷卻時，試劑中產(chǎn)生的溫度梯度引起自然對流，使得試劑循環(huán)通過 DNA 擴增所需的熱梯度。

成功應(yīng)用此平臺有如下兩個挑戰(zhàn)： (1)當(dāng)只有一個溫度控制裝置時，需保證變性，退火和延伸所需流場和溫度場的穩(wěn)定性; (2)設(shè)計適合與平臺產(chǎn)生的溫度梯度一起使用的引物和擴增子。

圖 2A

圖 1B (頂部) 顯示了從毛細(xì)管下端加熱，其內(nèi)部試劑循環(huán)一圈溫度的變化情況。(the hottest temperature) 位于毛細(xì)管底部，(the lowest temperature)位于毛細(xì)管上方 (油和試劑接觸的部分)。 為確保 PCR 擴增的三個步驟發(fā)生在毛細(xì)管內(nèi)部，(擴增子的變性溫度)應(yīng)低于，(引物的解鏈溫度；melting temperature of the primer)應(yīng)高于 。顯然，在變性/退火/延伸步驟中有效反應(yīng)的時間取決于溫度差：和 。 Primers with melting temperatures in the range of 52-58°C generally produce the best results.

圖 2B CCPCR (上圖) 和傳統(tǒng) PCR (下圖) 之間樣品溫度曲線的比較。傳統(tǒng) PCR 在每一步擴增中都保持恒定的溫度，并且整個管中一次只能執(zhí)行一個擴增步驟，而 CCPCR 的溫度曲線沿毛細(xì)管的長度方向平滑變化，同時 PCR 擴增的不同步驟同時進行。

為了延長擴增的持續(xù)時間，可以通過調(diào)節(jié)熱系統(tǒng)或通過設(shè)計具有高解鏈溫度的特異性引物來調(diào)節(jié)和 。 如圖 3 所示，采用不同體積的樣品測量了油和試劑接觸部分的溫度。結(jié)果表明，樣品體積越大，越低。理論上講，可以增加更多的樣本量來降低以提供更長的有效擴增時間。

圖 3 當(dāng)熱浴鍋溫度設(shè)定在95°C時，油-樣品區(qū)的溫度隨著樣品體積的增加而降低

但是，如果流體路徑過長，可能會激發(fā)自然對流中的第二種運動模式：也就是說，流動模式可能會分成兩個或多個垂直循環(huán)路徑。對于更長的毛細(xì)管，流體流動可能會變得更加紊亂。 應(yīng)避免這些情況，以確保流體運動模式的穩(wěn)定性。進一步，腔室體積變大會增加所需 PCR 試劑的量進而增加反應(yīng)成本。因此，選擇了體積為 75μL 的毛細(xì)管來維持穩(wěn)定的熱對流環(huán)境。

圖 4 (I) 將底部厚度為 3mm 的商用玻璃毛細(xì)管放在具有直徑 3.2mm ，深 4mm 孔的鋁塊中加熱. (II) 一個塑料毛細(xì)管支架防止毛細(xì)管傾斜(支架高度(HH): 26 mm；礦物油: 10μL). (III)采用 PIV 進行流場分析. (IV) FLUENT 模擬顯示當(dāng)樣品高度為 18 mm (體積為75μL) 時，毛細(xì)管中流場的穩(wěn)定循環(huán)狀況.

如圖 4 所示， 采用 PIV 可視化了毛細(xì)管 (直徑: 2.3 mm) 中的流體流動情況，并通過 FLUENT 仿真模擬軟件進行了確認(rèn)。上述設(shè)計解決了流體流動產(chǎn)生的第一個挑戰(zhàn)和成功擴增所需的溫度場。

圖 5 h/d = 7.7, Ra = 時，毛細(xì)管對應(yīng)的溫度場和速度場分布. 對于第二個問題，在固定溫度條件下(°C , °C)，引物的最佳值應(yīng)該被測試。本文設(shè)計了 7 個在 57–80°C 范圍內(nèi)具有不同的引物對，通過上述平臺擴增 HBV。 如圖 6 凝膠電泳數(shù)據(jù)所示，CPCR不能使用≤ 70°C 的引物擴增靶 DNA，但 ≥ 72°C 的引物卻可以成功擴增靶 DNA。采用 ≥ 76°C 的引物，電泳 DNA 條帶的強度似乎更強。

圖 6

除了 之外，用于變性的 是影響 CPCR 擴增的另一個因素。如果試管中的太接近，CPCR 將失敗，因為雙鏈 DNA 不可能完全變性，這將不允許引物有效地退火至模板 DNA。這會降低平臺檢測長擴增子的能力，因為較長的長度或較高的 GC 含量通常會伴隨較高的變性溫度。 如圖 7I 所示，本文對范圍為 86–91°C 的四個 HBV 擴增子進行了測試，發(fā)現(xiàn) CPCR 可以在 < 87°C (??> 8°C) 的情況下擴增兩個擴增子 (122 和 169 bp)。 > 90°C 時 (< 5°C) 擴增其它兩個擴增子 (188 和 222 bp)。為了增加???,可以將加熱溫度從 95 °C 調(diào)整為 99 °C。 在圖 7BII 中可得出，??> 90°C 時，188 和 222 bp 的擴增子均出現(xiàn)弱帶，表明較大的值可以成功擴增具有較高值的 DNA 模板。 應(yīng)當(dāng)注意，圖 7BII 中122 和169 bp 擴增子的條帶均比圖 7BI 中的條帶弱。原因可能為，當(dāng) ≤ 86°C 時，這兩個擴增子的引物退火效率會因油-試劑處溫度的升高而降低。

圖 7

也可以使用化學(xué)方法通過添加二甲基亞砜 (DMSO) 來降低擴增子的 ，從而增強 DNA 二級結(jié)構(gòu)的變性。但是，DMSO 也會影響模板上的引物退火，因為引物的降低，在某些情況下可能會對 CPCR 擴增產(chǎn)生不利影響 (如圖 7BIII)。 保持相同的熱場(°C, °C) 對于在毛細(xì)管中保持一致的流場和溫度場分布很重要，而且如果可以選擇具有所需的擴增子而不改變引物的會更好。 選擇低是擴增長擴增子的策略，但存在加熱器溫度必須保持在 95°C 的限制。因此，本文嘗試使用 CPCR 擴增 7 個不同長度的擴增子，從 208 到 816 bp。

圖 8

如圖 8 所示，CPCR 可以擴增 DNA≤500 bp 的長度。這揭示了和在 CPCR 中的重要性，而傳統(tǒng) PCR 則更多地依賴于。 總之，對于任何 DNA 模板，CPCR的經(jīng)驗法則是采用具有高的引物和低的擴增子。 為了證明這一規(guī)則，如圖 9 所示，本文選擇了幾種 ≤500 bp (≤ 87°C，≥ 76°C ) 的不同病毒擴增子進行檢測，成功的實現(xiàn)全部擴增。

圖 9

如圖 10 所示，HBV 質(zhì)粒DNA的測試靈敏度為每個反應(yīng) 30 份。高拷貝和低拷貝 HBV DNA 序列 (分別為 3000 和 3??????0??????拷貝/管) 僅在 30 分鐘內(nèi)通過 CCPCR 擴增。

圖 10 (上圖) 傳統(tǒng) PCR (圖片右半部分) 和 CCPCR (圖片左半部分) 擴增從 到 3 的初始 DNA 拷貝數(shù)。傳統(tǒng) PCR 的總反應(yīng)時間為 1 小時 40 分鐘，CCPCR 為 30 分鐘。(下圖)使用高和低DNA濃度通過 CCPCR 進行擴增的時間流程 (初始 DNA拷貝數(shù)：3000，左；30，右) 本文研究表明，這種簡單的擴增方法確實需要對擴增子和引物 (高引物和低擴增子) 進行重新設(shè)計和優(yōu)化，以使其具有與傳統(tǒng) PCR 相當(dāng)?shù)男阅堋?這種優(yōu)化增加了和 的相對溫差，從而延長了變性/退火/延伸反應(yīng)的空間和時間。

圖 11 毛細(xì)管對流 PCR 在不同環(huán)境溫度下的反應(yīng)。初始 DNA 拷貝為1000 份

一個主要的擔(dān)憂是環(huán)境溫度可能會對 CPCR 產(chǎn)生影響，因為該平臺使用環(huán)境溫度作為冷卻機制。 如圖 11 所示，本文測試發(fā)現(xiàn)，CPCR 在冰箱中 4°C 和暖箱中 33°C 均有效，但當(dāng)環(huán)境溫度 > 38°C 時 CPCR 擴增失敗。因此，除了極熱的地方外，CPCR 與一般的室內(nèi)操作兼容。

參考文獻

Rapid DNA amplification in a capillary tube by natural convection with a single isothermal heater.

編輯：黃飛