雙光子吸收效應(yīng)在量子光學(xué)領(lǐng)域是一個(gè)歷史悠久的理論，1931年由Maria G?ppert-Mayer在她的博士論文中提出。直到1990年底，鎖模激光器的出現(xiàn)才通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證雙光子吸收現(xiàn)象。

在這一時(shí)期，康奈爾大學(xué)Webb實(shí)驗(yàn)室是第一個(gè)使用雙光子顯微成像技術(shù)來(lái)觀察活細(xì)胞中的染色體；1994年從這個(gè)實(shí)驗(yàn)室出來(lái)的德國(guó)科學(xué)家Winfried Denk最早將雙光子技術(shù)應(yīng)用在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域。

之后，美國(guó)科學(xué)家Karel Svoboda在1997年成功用雙光子成像觀察了小鼠腦中的神經(jīng)細(xì)胞。時(shí)至今日，雙光子顯微系統(tǒng)在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域有了極大的發(fā)展，近年來(lái)，光遺傳光刺激也更多地和雙光子技術(shù)結(jié)合，廣泛地應(yīng)用于清醒小動(dòng)物。

在傳統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡中，光通過(guò)處的所有樣品都被激發(fā)，所以必須用孔徑光闌來(lái)選取焦點(diǎn)處樣品發(fā)出的熒光?？讖焦怅@不僅遮擋了焦點(diǎn)以外樣品發(fā)出的熒光，而且也遮擋了焦點(diǎn)處散射和漫反射的熒光。

多光子顯微鏡常稱(chēng)作非線(xiàn)性、雙光子激光掃描顯微鏡，是建立在先進(jìn)的超快脈沖激光掃描技術(shù)基礎(chǔ)上的顯微鏡實(shí)驗(yàn)方法，在更深入的層面上提供了更優(yōu)秀的光學(xué)切片能力。

熒光分子同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子到激發(fā)態(tài)，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)大于激發(fā)光波長(zhǎng)一半的較短的光子，從而實(shí)現(xiàn)成像。

這種技術(shù)需要超快激光器，由于其具有非常高的峰值功率和較低的平均功率，從而可以減小或者消除光漂白和光毒作用。多光子的吸收現(xiàn)象是非線(xiàn)性效應(yīng)，只發(fā)生在聚焦焦點(diǎn)處，不需要共聚焦孔徑光闌濾光，從而大大提高成像亮度和信噪比。

在過(guò)去的二十年中，鈦：藍(lán)寶石激光器是許多機(jī)構(gòu)多光子應(yīng)用的主力光源。因?yàn)樗麄兲峁┑牟ㄩL(zhǎng)可調(diào)諧，具有非常高的飛秒激光脈沖輸出功率。

由于鈦：藍(lán)寶石激光器具有極其復(fù)雜和極具挑戰(zhàn)的調(diào)試校準(zhǔn)過(guò)程，現(xiàn)在鎖模的光纖飛秒激光器在多光子顯微鏡中成為極具吸引力的光源。Toptica的光纖飛秒激光器可提供廣泛的波長(zhǎng)選擇方案，這些激光具有非常高的脈沖峰值功率和較低的平均功率，在持續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)上不需要額外的維護(hù)和任何水冷設(shè)備。另外，我們采用的SAM被動(dòng)鎖模，具有優(yōu)秀的模式穩(wěn)定性和更高的性?xún)r(jià)比。

Toptica的FemtoFiber Pro型號(hào)從一個(gè)孔徑發(fā)射亞100fs 脈沖，輸出波長(zhǎng)780nm（>100mW）和 1030nm（>200mW），可獨(dú)立調(diào)制強(qiáng)度、脈寬（啁啾）以及相應(yīng)的脈沖間延遲，這些可調(diào)節(jié)的參數(shù)在活體細(xì)胞多色雙光子成像、寬帶相干反斯托克斯拉曼光譜（CARS）、受激拉曼光譜（SRS）研究，以及泵浦-探測(cè)實(shí)驗(yàn)和脈沖受激發(fā)射耗盡（STED）顯微應(yīng)用中，能夠大顯身手。我們的飛秒光纖激光器可提供波長(zhǎng)在1μM以上的激光，這些激發(fā)光束受散射影響較小更容易穿透標(biāo)本，對(duì)活性標(biāo)本的殺傷極小，因此非常適用于活細(xì)胞成像，尤其是厚的活組織如腦片、胚胎、整個(gè)器官甚至整個(gè)機(jī)體的成像研究。

Toptica光纖激光器將來(lái)會(huì)成為多光子等先進(jìn)的顯微技術(shù)的主力，如雙光子、寬帶拉曼和其他時(shí)間分辨的應(yīng)用等。光纖激光器具體參數(shù)如下圖：

應(yīng)用示例：

雙光子成像系統(tǒng)簡(jiǎn)圖

受體神經(jīng)元軸突，使用鈦：藍(lán)寶石激光器和我們的光纖飛秒激光器FemtoFiber pro NIR的雙光子成像對(duì)比圖

海馬體回CA1錐體神經(jīng)元使用Fluo-4和Alexa 594標(biāo)記試劑填(~50 μm 深)，使用FemtoFiber pro NIR和Femtonics Femto2D顯微鏡成像，目標(biāo)后孔的平均功率為10mW。