多光子成像技術(shù)是一種光學(xué)成像技術(shù)，其核心在于利用光子在樣品內(nèi)產(chǎn)生的非線性光學(xué)效應(yīng)，實現(xiàn)高分辨率的三維成像。

在多光子激發(fā)成像過程中，激光光束作用于樣品，通過雙光子或多光子吸收，產(chǎn)生非共振熒光或次諧波。這種非線性光學(xué)效應(yīng)使得多光子顯微鏡具有比傳統(tǒng)顯微鏡更高的空間分辨率和深度分辨率。

在實際應(yīng)用中，多光子顯微鏡在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、納米科學(xué)、材料科學(xué)等許多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。例如，它可以用于對生命科學(xué)領(lǐng)域的細胞和生物分子進行研究，通過組織的深度成像、減少細胞萎縮等優(yōu)點，極大地促進了醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展。

多光子成像技術(shù)原理及特點

多光子激發(fā)是指在具有高光子密度的入射光激發(fā)下，處于基態(tài)的分子/原子同時吸收多個光子后躍遷到激發(fā)態(tài)，經(jīng)過弛豫過程躍遷到亞穩(wěn)態(tài)，最后自發(fā)輻射回到基態(tài)，釋放出頻率略小于多倍入射光頻率的熒光光子。

圖一 2PEF、3PEF過程能級示意圖

由于整個過程中存在非輻射的能量損失，激光光子的能量總是會大于激發(fā)光光子的能量，也就熒光的波長會小于激光的波長。在雙光子吸收過程中，熒光分子吸收兩個能量較低（波長較長）的光子到達激發(fā)態(tài)，并在躍遷回到基態(tài)時產(chǎn)生熒光，可用于熒光成像。

但也不是任意兩個光子就可以激發(fā)同一個熒光分子的，熒光分子在吸收了第一個激發(fā)光子后，等待吸收第二個光子的中間態(tài)只能維持幾十飛秒，這要求激發(fā)光束中相鄰兩個光子的間隔必須小到幾十飛秒內(nèi)才能確保發(fā)生雙光子熒光激發(fā)現(xiàn)象產(chǎn)生，通過雙光子吸收截面公式δ=hνβ/（NAd0×10-3 ），可以得到一個大概值，也就是100GM（10-50cm-s/photon）。

相較于單光子激發(fā)熒光、激光掃描共聚焦和寬場成像等技術(shù)，多光子成像技術(shù)具有以下優(yōu)點：

01多光子成像技術(shù)通常采用的激發(fā)光為波長較長的近紅外光，相比可見光，近紅外光在生物組織中的穿透能力更強，能夠觀察到生物組織中更深層的信息，侵入性較低；

02多光子成像只有在激發(fā)光焦點附近的區(qū)域才能激發(fā)熒光（如圖二），因此多光子成像技術(shù)具有天然的光學(xué)層析能力，能更好地對生物組織進行三成像；

03多光子成像在樣品的非焦點區(qū)域不產(chǎn)生熒光，能自動抑制離焦信號，因而相比寬場成像技術(shù)，多光子成像能實現(xiàn)近乎衍射極限的空間分辨率，因此能觀察到組織內(nèi)更細微的結(jié)構(gòu)；

04與共聚焦成像技術(shù)相比，多光子成像技術(shù)不需要使用針孔濾波，熒光收集效率高。

此外，多焦點多光子顯微技術(shù)（MMM）相較于單點掃描多光子顯微技術(shù)，具有更高的光能利用率和成像速度。它利用多個激發(fā)光點并行激發(fā)樣品并同時探測熒光信號，實現(xiàn)樣品的三維快速多光子激發(fā)熒光顯微成像。這種技術(shù)具有對活體樣品損傷小、成像深度大、圖像信噪比高等優(yōu)點，因此成為在分子和細胞水平上進行生物醫(yī)學(xué)研究的重要手段。

審核編輯：黃飛