在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究，診斷，醫(yī)藥產(chǎn)品測試或材料科學(xué)領(lǐng)域的各種光學(xué)顯微鏡應(yīng)用中，圖像處理是最重要的一環(huán)。本文說明了在不同應(yīng)用中選擇相機時要考慮的幾個因素：

要在顯微鏡中使用圖像處理，為各種顯微鏡應(yīng)用選擇最合適的組件至關(guān)重要。除顯微鏡本身外，還包括選擇正確的鏡片，照明，濾光片和偏光片，具體取決于所用的染料和對比方法。最終，相應(yīng)應(yīng)用的特殊要求對于選擇最合適的顯微鏡相機和兼容的圖像處理軟件起決定性作用。

1. 單色或彩色相機

圖1 單色傳感器(左)和帶有拜耳模式濾色器的傳感器(右)

彩色相機在應(yīng)用中非常靈活，是傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡廣泛領(lǐng)域不可或缺的一部分。包括生物醫(yī)學(xué)和臨床實驗室環(huán)境以及工業(yè)和材料研究中的許多常規(guī)微觀應(yīng)用。

因此，對于顯微鏡圖像，通常使用彩色相機。其顏色保真度和顏色再現(xiàn)應(yīng)盡可能準(zhǔn)確，以便能夠可重復(fù)地區(qū)分材料和生物樣品中最精細的結(jié)構(gòu)。此外，由于彩色照相機具有高靈敏度，因此在標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡這類光強度較低的應(yīng)用中，也能出色地完成任務(wù)。它們還適用于使用多頻帶濾波器同時監(jiān)測和記錄多個熒光團的應(yīng)用。

單色相機不包含顏色信息，它可提供有關(guān)圖像傳感器亮度值的完整信息。與彩色相機會因為通過濾色器吸收光能而導(dǎo)致光強損失相比，單色相機沒有光強損失。因此單色相機非常適合不需要顏色信息的復(fù)雜熒光顯微鏡應(yīng)用。

2.傳感器類型(CCD與CMOS)，幀速率，快門選項

圖2 CMOS傳感器

對于傳感器類型，主要有基于CCD(電荷耦合器件)和CMOS(互補金屬氧化物半導(dǎo)體)兩大類。CCD和CMOS傳感器都將光(光子)轉(zhuǎn)換為電信號。但它們二者的技術(shù)設(shè)計根本不同，因此它們的特性也不同。選擇正確的傳感器類型取決于應(yīng)用。一般來說，CCD傳感器因其低噪聲系數(shù)，高填充因子，強信噪比，圖像色彩保真度以及具有非常高的圖像質(zhì)量而脫穎而出。這些特性使得使用CCD傳感器的相機成為低光應(yīng)用的理想選擇。但近年來，COMS的高速(幀速率)和分辨率(像素數(shù))，較低的功耗以及最近改進的噪聲特性，動態(tài)，量子效率和色彩概念已經(jīng)使它們向包括顯微鏡應(yīng)用在內(nèi)的以前使用CCD傳感器的應(yīng)用開放。其中特別是高速度和現(xiàn)代CMOS傳感器的新顏色概念提供了出色的實時圖像。

幀速率用來描述傳感器每秒可以捕獲和發(fā)送的圖像的數(shù)量。幀速率越高，意味著傳感器越快，每秒捕獲的圖像越多，可以傳輸更高的數(shù)據(jù)量。對于自動化應(yīng)用，除了高圖像質(zhì)量之外還需要高吞吐量，因此需要更高的幀速率。例如對樣品的自動掃描，用于自動聚焦或多個圖像在短時間內(nèi)完整再現(xiàn)的應(yīng)用。

相機快門僅在曝光時打開，選擇合適的曝光時間以提供所需的光通量。主要有全局快門和滾動快門兩種選項。CCD傳感器始終使用全局快門，而CMOS傳感器則提供兩種型號。兩種快門之間的區(qū)別在于傳感器曝光圖像的方式：對于全局快門，整個傳感器同時暴露，這意味著光線同時照射到傳感器的整個表面。具有滾動快門的傳感器則以快速的時間順序(在幾微秒內(nèi))逐個單元地逐步曝光。比全局快門相比，帶有滾動快門的傳感器由于讀出噪聲低，具有更高的動態(tài)范圍。高動態(tài)性允許高質(zhì)量地記錄和分析詳細的結(jié)構(gòu)信息。但在樣品/樣品臺的非?？焖僖苿悠陂g或在曝光期間物體的移動可能導(dǎo)致失真，被稱為滾動快門效應(yīng)?？梢酝ㄟ^使用特定限制內(nèi)的曝光時間來防止?jié)L動快門效應(yīng)。

3.分辨率，像素點大小和傳感器尺寸

圖3 由不同像素數(shù)相機記錄的同一圖像

相機傳感器的分辨率是指傳感器上的像素數(shù)。例如，某相機具有500萬像素的分辨率，意味著光學(xué)系統(tǒng)投射到該傳感器上的圖像被分解為500萬像素點。對于顯微鏡相機，顯微鏡中相機的像素分辨率應(yīng)高于鏡頭的光學(xué)分辨率，建議像素分辨率至少是鏡頭光學(xué)分辨率的三倍。例如，若需要較低的放大倍率，則需要具有相應(yīng)高分辨率的相機，以實現(xiàn)顯微圖像的所有細節(jié)的理想記錄和再現(xiàn)。根據(jù)應(yīng)用的不同，300萬到500萬像素通常就足夠了。因為由于光學(xué)系統(tǒng)的限制，更高的分辨率通常不會提供任何附加圖像信息。

像素點大小也很重要。通常對于單色及彩色傳感器，像素最小分別為5μm和2.5μm是合理的選擇。

圖4 常見的傳感器尺寸(一英寸約等于16毫米)

對于顯微鏡相機來說，傳感器的尺寸通常在1/3“到1”之間。應(yīng)該比鏡頭的視場直徑略小，以便可以以理想清晰度再現(xiàn)傳感器圖像的所有區(qū)域。

圖5

最常見的用于微觀應(yīng)用的是具有4:3橫縱比的傳感器。

4.冷卻CCD/CMOS傳感器與非冷卻傳感器

任何傳感器都會產(chǎn)生暗噪聲或暗電流：熱量在傳感器芯片上的像素中產(chǎn)生電子，其與由光產(chǎn)生的電子混合，引起干擾以覆蓋所需的圖像信息使圖像內(nèi)容失真。暗電流和噪聲與傳感器溫度成正相關(guān)，在運行期間，傳感器溫度增加會導(dǎo)致更大的噪聲。通過冷卻傳感器可以減少暗電流。假設(shè)圖像信號保持不變，將傳感器溫度降低7°C可降低約一半暗電流。

通常非冷卻傳感器能夠滿足大部分應(yīng)用，但如果在較弱的照明條件下需要特別長的曝光時間，或者如果圖像分析或進一步處理需要特別恒定且可重復(fù)的結(jié)果，則冷卻傳感器是正確的選擇。例如體內(nèi)生物發(fā)光應(yīng)用或天文學(xué)中的應(yīng)用。

5.總結(jié)：

如果要使用彩色相機，請確保相機提供顏色配置。對于復(fù)雜的熒光應(yīng)用，考慮使用單色相機產(chǎn)生較少的噪音。如果要以低放大倍率再現(xiàn)大部分樣品，請選擇高分辨率。對于標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡應(yīng)用，幀速率較低的相機通常能夠滿足需要。使用合適的軟件可以顯著提高圖像質(zhì)量，始終使用相機的最新軟件版本。

審核編輯 黃宇